1926年5月，周桂生加入中国共产党，受党组织派遣回到湘潭。同年8月，被选为湘潭县农民协会副委员长兼纠察总队队长。9月，在杨昭植指挥下，县农民协会、县总工会根据群众的要求和省政府颁布的《惩治土豪劣绅暂行条例》，由周桂生带领纠察队员提审县内最大的劣绅，县团防局局长、财政科长晏容秋。县农民协会、县总工会召开有数万名群众参加的公审大会，经特别法庭判决，纠察队将这个作恶多端的劣绅处决于学坪。这一行动，得到了后面来湘潭考察农民运动的毛泽东的高度肯定。

1927年1月，对英绝交委员会湘潭县分会及县雪耻分会成立，周桂生被选为主要领导成员之一，参与所属行动委员会的领导工作。与杨昭植等发动工人罢工、商人罢市、学生罢课，反对帝国主义在中国内河享有航行权，不准英船入港；扣押在潭英商，讯问日商等。行动委员会在学坪召开有数万人参加的反英示威大会，在学坪烧毁英货计千件，在太平街烧掉英商煤油2000余桶。同年2月，一支自称“国民革命军独立第三团”的地主武装，驻扎在姜畲镇祖师庙，敲榨勒索，破坏革命。县农民协会、总工会委派他任指挥，带领工人纠察队消灭这支武装。纠察队与这股反动武装首战于祖师庙，再战于距姜畲约3华里的一个村庄，全歼独立团，缴获步枪300余支，俘该团头目马堂富（原某军阀部队中之营长）。

长沙马日事变后，许克祥对共产党人和革命群众实行大屠杀。为挽救危局，他与杨昭植、郭咏泉等组织工农自卫军，夺取县团防总局及警察队的枪支，集结于姜畲，与湘乡、宁乡等地农军组成湖南工农义勇军中路军，准备进攻长沙。由于受右倾投降主义的影响，工农义勇军被瓦解。但他仍坚持武装革命，与北一区农协委员长许克昌一起，率领北一区农军在鹞子岩阻击许克祥部。因寡不敌众，部分农军被迫撤至北一区农民协会驻地赵塘。随后许克祥部伪造县农民协会召开紧急会议的通知，诈他赴会，将其逮捕。1927年6月17日，周桂生被杀害于县城文庙前学坪，年仅31岁。